液氮罐低溫菌種保藏技術(shù)的原理及方法

　　菌種是主要的生物資源，也是食用菌生產(chǎn)首要的生產(chǎn)資料。一個(gè)優(yōu)良的菌種被選育出來(lái)以后，必須保持其優(yōu)良性狀不變或盡可能地少變慢變，才不至于降低生產(chǎn)性能，能長(zhǎng)期在生產(chǎn)中使用。因此，菌種保藏在食用菌生產(chǎn)上具有重要的意義。

　　一、菌種保藏原理

　　菌種保藏的方法很多，但原理大同小異。首先要挑選優(yōu)良純種。利用微生物的孢子、芽孢及營(yíng)養(yǎng)體;其次，根據(jù)其生理、生化性，人為創(chuàng)造低溫、干燥或缺氧等條件，抑制微生物的代謝作用，使其生命活動(dòng)降低到極低的程度或處于休眠狀態(tài)，從而延長(zhǎng)菌種生命以及使菌種保持原有的性狀，防止變異。不管采用哪種保藏方法，在菌種保存過(guò)程中要求不死亡、不污染雜菌和不退化。

　　二、菌種保藏的方法

　　1、低溫定期移植保藏法。將需要保藏的菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，適溫培養(yǎng)，當(dāng)菌絲健壯地長(zhǎng)滿(mǎn)斜面時(shí)取出，放在3-5℃低溫干燥處或4℃冰箱、冰柜中保藏，每隔4-6個(gè)月時(shí)間移植轉(zhuǎn)管一次，具體應(yīng)根據(jù)菌種特性決定。保藏時(shí)要注意環(huán)境溫度不能太高，以防霉菌通過(guò)棉塞進(jìn)入管內(nèi)。因此，若用棉塞，可用干凈的硫酸紙或牛皮紙包扎棉塞，即可減少污染的機(jī)會(huì)，也可防止培養(yǎng)基干燥。除草菇菌種外，其他食用菌菌種都能采用此法保藏。

　　2、液體石蠟保藏法。取化學(xué)純液體石蠟(要求不含水分、不霉變)裝于三角瓶中加棉塞并包紙，在1公斤/平方厘米壓力下滅菌1小時(shí)，再放入40℃恒溫箱中數(shù)天，以蒸發(fā)其中水分，至石蠟油完全透明為止。將處理好的石蠟油移接在空白斜面上，28-30℃下培養(yǎng)2-3天，證明無(wú)雜菌生長(zhǎng)方可使用。然后用無(wú)菌操作的方法把液體石蠟注入待保藏的斜面試管中。注入量以高出培養(yǎng)基斜面1-1.5厘米，塞上橡皮塞，用固體石蠟封口，直立于低溫干燥處保藏。保藏時(shí)間在一年以上，在低溫下，保藏時(shí)間還可延長(zhǎng)。

　　3、沙土管保藏法。取河沙用水浸泡洗滌數(shù)次，過(guò)60目篩除去粗粒，再用10%鹽酸浸泡2-4小時(shí)，除去其中有機(jī)物質(zhì)，再用水沖洗至流水的ph達(dá)到中性，烘干備用。同時(shí)取貧脊土或菜園土用水浸泡，使呈中性，沉淀后棄去上清液，烘干碾細(xì)，用100目篩子過(guò)篩，將處理好的沙與土以(2-4):1混勻，用磁鐵吸出其中的鐵質(zhì)，然后分裝小試管或安瓿內(nèi)，每管裝量0.5-2克，塞棉塞，用紙包扎滅菌(1.5公斤/平方厘米，1小時(shí))，再干熱滅菌(160℃，2-3小時(shí))1-2次，進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，合格后使用。將已形成孢子的斜面菌種，在無(wú)菌條件下注入無(wú)菌水3-5毫升，刮菌苔，制成菌懸液，再用無(wú)菌吸管吸取菌液滴入砂土管中，以浸透砂土為止。將接種后的沙土管放入盛有干燥劑的真空干燥器內(nèi)，接上真空泵抽氣數(shù)小時(shí)，至沙土干燥為止。真空干燥操作需在孢子接入后48小時(shí)內(nèi)完成，以免孢子發(fā)芽。制備好的沙土管用石蠟封口，在低溫下可保藏2-10年。

　　4、濾紙片保藏法。取白色(收集深色孢子)或黑色(收集白色孢子)濾紙，剪成4×0.8厘米的小紙條，平鋪在培養(yǎng)皿中用紙包裹進(jìn)行滅菌(1公斤/平方厘米，30分鐘)。采用鉤懸法收集孢子，讓孢子落在濾紙條上。將載有孢子的濾紙條放入保藏試管中，再將保藏試管放入干燥器中1-2天，除去濾紙水分，使濾紙水分含量達(dá)2%左右，然后低溫保藏。

　　5、自然基質(zhì)保藏法

　?、披溋１２胤ǎ喝o(wú)癟粒、無(wú)雜質(zhì)的小麥淘洗干凈，浸泡12-15小時(shí)，加水煮沸15分鐘，繼續(xù)熱浸15分鐘，使麥粒脹而不破，瀝干水分?jǐn)傞_(kāi)晾曬，使麥粒的含水量在25%左右。將碳酸鈣、石膏拌入熟麥粒中(麥粒、碳酸鈣、石膏比例為10公斤:133克:33克)，拌和均勻后裝入試管中，每管約2-3克，然后清洗試管，塞棉塞，滅菌1.5(1.5公斤/平方厘米，2小時(shí))，經(jīng)無(wú)菌檢查合格后備用，試管基質(zhì)冷卻后接種，適溫培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)基質(zhì)后用石蠟涂封棉塞，放低溫保藏。2年左右轉(zhuǎn)接一次。

　　⑵麩曲保藏法。取新鮮麩皮，過(guò)60目篩除去粗粒。將麩皮和自來(lái)水按1:1拌勻，裝入小試管，每管約裝1/3高度，加棉塞用紙包扎，高壓滅菌(1.5公斤/平方厘米，30分鐘)，經(jīng)無(wú)菌檢查合格后備用，將生長(zhǎng)在斜面培養(yǎng)基上的健壯菌種，移種至無(wú)菌麩曲管中，移種時(shí)注意盡管搗勻小試管中的麩皮，呈疏松狀態(tài)，在適溫下培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)麩皮為止，將麩曲小管置干燥器中，在低溫或適溫下保藏。

　　6、生理鹽水保藏法。取純氯化鈉0.7-0.9克，放入100%毫升蒸餾水中，攪拌均勻分裝試管，每管5-10毫升，進(jìn)行滅菌(1公斤/平方厘米，30分鐘)，經(jīng)無(wú)菌檢查合格后備用，將待保藏的菌種接入馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中適溫振蕩培養(yǎng)5-7天。無(wú)菌操作吸取少許培養(yǎng)菌種注入經(jīng)檢驗(yàn)合格的生理鹽水試管中，塞上無(wú)菌橡皮塞，用石蠟涂封，在室溫或低溫保藏。

　　7、冷凍真空干燥法。將已培養(yǎng)、生長(zhǎng)豐富的菌體或孢子懸浮于滅菌的血清、卵白、脫脂奶制成菌懸液，將懸液以無(wú)菌操作分裝于滅菌的玻璃安瓿瓶中，每管約0.3-0.5毫升，然后用耐壓橡皮管與冷凍干燥裝置連接，安瓿瓶放在冷凍槽中于-30℃至-40℃迅速冷凍，并在冷凍狀態(tài)下抽空干燥，并在真空狀態(tài)下熔封安瓿，在-20℃保存，一般可保存十年以上，但成本較高。

　　8、液氮超低溫保藏法。首先將要保藏的菌種制成菌懸液備用;其次，準(zhǔn)備安瓿瓶，每瓶加入0.8毫升冷凍保護(hù)劑10%(體積比)甘油蒸餾水溶液，塞棉塞滅菌(1公斤/平方厘米，5分鐘)。無(wú)菌檢查后，接入要保藏的菌種，火焰熔封瓶口，檢查是否漏氣，將封好口的安瓿瓶放在凍結(jié)器內(nèi)，以每分鐘下降1℃的速度緩慢降溫，使保藏品逐步均勻地凍結(jié)，直至-35℃，以后凍結(jié)速度就不需控制，安瓿凍結(jié)后立即放入液氮罐內(nèi)，在-150至-196℃保藏，該法只有少數(shù)科研院所使用。