研究豬胚胎多能樣干細胞分離培養的方法

豬胚胎干細胞分離培養自我更新和分化潛能，利用不同培養條件，從孤雌胚胎、細胞核移植胚胎和體內受精胚胎中分離樣細胞。液氮容器

1.細胞培養用于核移植供體的豬胎兒成纖維細胞

從初生豬仔的耳部分離得到。細胞培養基為DMEM，15%胎牛血清，培養溫度為37℃，5%CO2。細胞凍存，使用0.25%(W/V)的胰蛋白酶消化，中和后離心200Xg，5min。將細胞重懸后并加入等量凍存液(40%DMEM，40%FBS和20%DMSO)，貯存在液氮中。

2.卵母細胞的收集和準備

從屠宰場收集豬卵巢，保存在含有青/鏈霉素的生理鹽水中，運輸溫度32~38℃，3h內運回實驗室。采用抽吸法采集卵巢卵母細胞。抽取3~6mm卵泡中的卵母細胞置于15mL離心管中，37℃水浴靜置數分鐘，待卵母細胞沉降后，用洗卵液洗2遍，顯微鏡下挑取顆粒細胞層達3層以上的卵丘卵母細胞復合物(cumulusoocytecomplex，COCs)，然后將COCs轉入U型皿中培養42~44h，每孔加500µL成熟培養液，每孔放置50~70枚。

3.孤雌激活和胚胎培養

用電融合儀將成熟的卵母細胞進行電激活，漂洗后，將卵母細胞移至2mmol/L6D孵育2.5h。分別將卵母細胞轉移到胚胎培養基G1、NCSU23和豬受精卵培養基，24h后記錄卵裂率。3d后，將培養基G1中發育的胚胎移入囊胚培養基G2。再次培養3~4d后，統計囊胚個數并收集。

4.體細胞核移植胚胎培養

去除成熟卵母細胞第一極體，隨后注入供體細胞。顯微操作后，移入含10%FBS的M199培養基，在38.5℃，5%CO2條件下孵育0.5h，使用電融合儀進行激活處理，移入6D孵育2.5h后，將重組胚胎在NCSU23培養基中培養3d，隨后替換NC-SU23繼續培養3~5d，觀察胚胎的發育。

5.體內胚胎的收集

從人工受精的母豬體內收集第7~8d的囊胚，所有方法參照Stokes等（2005)。每天監測母豬的發情，將發情日期作為0d，鑒定發情后的6、12和18h進行人工受精。從子宮沖洗胚胎時使用預熱的含10%FBS的磷酸緩沖鹽溶液(phosphatebuffersa-line，PBS)。

6.從豬胚胎分離胚胎多能干細胞

將去除透明帶的囊胚接種到絲裂霉素C(mi-tomycin-C)處理過的小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonicfibroblastcells，MEFs)飼養層上2~4d，囊胚內細胞團(innercellmass，ICM)在3~5d后出現。待ICM大小適中時，用機械法分離細胞，重鋪到新的飼養層上，并使用不同的豬胚胎干細胞(por-cineembryonicstemcells，pESCs)培養基(ESM1~ESM6，表1)，胚胎多能干細胞克隆每5~7d使用機械法傳代。液氮容器

7.免疫熒光檢測

使用4%多聚甲醛固定胚胎10min，PBS洗2次后，加入0.25%Triton-X室溫30min，PBS洗3次，1%BSA室溫封閉1h，4℃孵育一抗24h(1∶200，CDX2;1∶200NANOG)。PBS沖洗3次，孵育熒光標記的二抗(1∶1000)室溫1h。PBS沖洗2次后，DAPI染色2min，PBS沖洗2次后在熒光顯微鏡下觀察照相。

8.qRT-PCR

使用0.5%鏈霉蛋白酶A去除豬胚胎的透明帶后，立刻加入5μL的裂解緩沖液(5mmol/L二硫蘇糖醇，1%NP-40，1U/uLRNA酶抑制劑)，冰上孵育30min。使用反轉錄試劑盒將裂解液反轉錄為cDNA。qRT-PCR體系：cDNA2μL，SYBRgreenmix12.5μL，上下游引物各0.3µmol/L0.5μL，ddH2O補充到25μL。反應程序：95℃30s；95℃5s，60℃30s，共40個循環。