液氮保存對人主動脈瓣組織細胞活力的影響

　　20世紀60年代初，Ross首次成功地將人同種主動脈瓣原位移植于人體，經過近40a臨床技術和瓣膜保存方法的不斷改進，國內外有關活性同種異體主動脈瓣的研究不斷發展，同種生物瓣的研究和應用取得了很大進步。人同種帶瓣管道具有中心血流、抗鈣化及抗血栓形成且無需術后長期抗凝治療等優點，從而在臨床應用上顯示出其他瓣膜無可比擬的優越性及應用前景。盡管臨床上瓣膜的應用歷史比較早，但國內外對于同種瓣膜的組織活性與冷凍保存時間的相關性研究尚少見報道。本研究目的在于通過對瓣膜組織活性的量化，探討適宜的瓣膜保存期限，為臨床應用同種異體瓣提供可靠的實驗依據。

　　1、材料和方法

　　1.1 材料

　　選用(18～35)歲健康成年男性腦死亡30min內取材的主動脈瓣20個。供體心臟均在腦死亡后30min內無菌取出，剪開心臟四腔，4℃生理鹽水沖洗3次，用3層無菌塑料袋盛入供心并逐層線扎，冰壺帶回，在無菌臺上修剪成帶瓣管道。實驗分為新鮮瓣膜對照組(Ⅰ組)和冷凍保存組(Ⅱ～Ⅹ組)。對照組取材后不入液氮內保存，瓣葉剪下后直接供實驗用。冷凍保存組依據在液氮((196℃)中保存時間分為Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ，Ⅷ，Ⅸ，Ⅹ組，分別為冷凍保存1，3，6，9，12，15，18，21，24mo的瓣膜。每組2個瓣膜共6個瓣葉。

　　1.2 方法

　　修剪備用的帶瓣主動脈管道浸入含低濃度抗生素和二甲基亞砜(DMSO)的RPMI1640營養液中，3層無菌耐低溫塑料袋分別束扎，外裹錫箔袋，標記時間后，置入4℃冰箱中2h，再置入液氮蒸氣中使瓣膜緩慢降溫，最后放入液氮中長期保存，降溫速率保持在1℃?min-1 左右。定期添加液氮，使瓣膜始終保持在-196℃。實驗當日取保存不同時間的帶瓣管道在37℃水浴箱中快速復溫5min，然后掀去包裹薄膜，再在37℃無菌生理鹽水中快速復溫，復溫中不斷輕柔翻動帶瓣管道，使其各部位的溫度均勻上升。新鮮組瓣膜及冷凍復溫后各組瓣膜均在超凈工作臺上無菌取出，剪切瓣葉并觀察其大體形態，分切瓣葉并切成1mm×1mm×1mm組織碎塊做以下實驗分析。

　　1.2.1 瓣膜細胞活力測定

　　組織碎塊置入2。5g?L-1 胰蛋白酶溶液在室溫下消化2～3h，200目鋼網過濾，濾液經1500r?min-1 離心10min，去上清液，加入少量營養液終止消化，1500r?min -1 離心10min，去上清液，制備成5×106左右的細胞懸液，加入20g?L-1 胎盼藍，滴入血細胞計數器，光鏡下計數四個大格內的著色細胞和拒染細胞即活細胞，根據下式計算細胞活力：細胞活力=[拒染細胞數/(著色細胞數+拒染細胞數)]×100%

　　1.2.2 組織培養觀察

　　各組瓣膜組織碎塊置入25mL培養瓶內，待組織塊貼壁后，加入少量含100mL?L-1 胎牛血清(FCS)的RPMI1640營養液中，在37℃含50mL?L-1 二氧化碳培養箱中孵育72h，觀察組織生長情況并追加少量營養液。以后每3d更換營養液一次，培養后3，7，10，14，17，21，24和28d在倒置光相差顯微鏡下觀察并攝像記錄。

　　統計學處理：瓣膜細胞活力測定結果以(x ±s%)表示，用SigmaStat2。0統計軟件包處理，冷凍保存組各組與新鮮瓣膜組組間數據行t檢驗，P<0。05為有顯著性差異。

　　2、結果

　　2.1 瓣膜細胞活力

　　Ⅰ組瓣膜細胞活力最大，為93.85%。Ⅱ～Ⅹ組細胞活力均較Ⅰ組減低(P<0.05)，且隨保存時間加長而逐漸減低;Ⅷ，Ⅸ，Ⅹ各組的細胞活力與Ⅰ組及Ⅱ～Ⅶ組相比明顯減低(P<0.05，Tab1)。表1 新鮮瓣膜組與冷凍保存瓣膜組的細胞活力對比(略)。

　　2.2 組織培養

　　Ⅰ組組織培養1wk時細胞從組織塊邊緣開始移行，細胞增殖較快，細胞數目較多，4wk時鏡下細胞占滿培養瓶壁;Ⅱ～Ⅶ組瓣膜組織細胞移行較新鮮瓣膜組稍晚，約1～2wk時間，細胞增 殖稍慢，細胞數目仍較多，4wk時鏡下細胞數較多;Ⅷ～Ⅹ組瓣膜組織細胞在2wk后開始移行，細胞增殖較慢，細胞數目較少，4wk時鏡下細胞數較Ⅰ組明顯減少(Fig1～6)。

　　3、討論

　　人同種主動脈瓣具有中心血流、抗鈣化及抗血栓形成且無需術后長期抗凝治療等優點，從而在臨床應用上顯示出其他瓣膜無可比擬的優越性及應用前景。

　　臨床資料表明，人活性同種主動脈瓣的耐久性(dura-bility)優于無活性瓣膜。1962年，Ross首先在臨床上將人同種主動脈瓣(human aortic valve homo-graft，HAVH)原位置換成功。同年Barratt-Boyes 報道了44例HAVH置換的成功經驗，但這些瓣膜活性喪失，瓣膜10a衰壞率較高。

　　1960年代后期，臨床采用4℃營養液保存的HAVH，其組織細胞在保存液中可存活1wk，瓣膜壽命延長，衰壞率降低。1970年代后期，O’Brien等采用液氮保存的HAVH(cry-opreserved aortic valve homograft，CAVH)，行主動脈置換術192例，發現瓣膜耐久性明顯提高，10a衰壞率為零;同時發現CAVH植入宿主體內9a3mo，經細胞培養證明供體瓣纖維細胞能在宿主體內長期存活，并提出纖維細胞存活的同種活細胞瓣膜(viable aortic valve homograft，VAVH)的概念。VAVH具有良好的血流動力學、較強的抗感染、抗血栓作用且無需抗凝治療，它的抗張強度較無活性瓣膜大為提高，所有上述功能的優越性都基于瓣膜組織良好的結構完整性，包括纖維細胞功能代謝正常及纖維支架的形態結構較完整等。HAVH的采集、滅菌處理、保存方法等均可影響瓣膜活性和組織代謝。采集時主要考慮二種因素的影響：供體的年齡和熱缺血時間(warm ischemia time，WIT)。供體選擇健康成年人，年齡多在20～35歲。

　　有資料表明，超過45歲的供體臨床使用后易發生瓣膜蛻變、鈣化和關閉不全。供體在心腔冷灌前主要為熱缺血損傷，隨WIT延長，組織細胞可發生胞質水腫、內質網擴張、線粒體腫脹等可逆性損傷，隨WIT不斷增加，細胞可產生線粒體絮狀沉積、核膜溶解、核染色質丟失、細胞裂解等不可逆性損傷，最終導致細胞死亡，因此應盡量縮短WIT。本研究中WIT控制在30min內，及時對供體心腔用4℃生理鹽水冷灌沖洗，盡快清除殘留在心腔及瓣膜上的血塊，有效地降低了瓣膜組織溫度，使瓣膜組織細胞代謝減慢，從而減低組織細胞因缺血缺氧產生的損傷。HAVH采集后應及時進行滅菌處理。瓣膜應用早期，滅菌時使用毒性較大的化學物質或以高能電子射線照射，組織抗張強度差，瓣膜耐久性差，已不再使用。目前瓣膜滅菌普遍采用低濃度抗生素滅菌法，這種方法能較好地保存組織活細胞。我們采用的HAVH處理和滅菌方法源于美國鹽湖城的L.D.S醫院，并把保存液中的小牛血清含量提高5%，經此方法處理和冷凍保存的瓣膜臨床應用效果良好。瓣膜在降溫過程中加用適宜濃度的冷凍保護劑(甘油、DMSO等)，可有效地減少冷凍損傷。冷凍降、復溫對瓣膜組織結構，特別是內皮細胞影響較大。采用快速降溫(10～100℃?min-1 )時，細胞質、細胞核和染色體內均有冰晶形成，細胞膜結構易于破裂;溫度驟降使細胞內酶變性導致低溫休克(thermal shock)對細胞的損害作用更甚于冰凍的機械作用。本實驗證明，緩慢降溫對組織的破壞較輕，而采用1℃?min-1 降溫效果最佳，這與有些報道結果相同。在不同的降溫速率，DMSO對組織細胞的 影響也不同，1℃?min-1 降溫時DMSO的適宜濃度為100g?L-1 。復溫常采用37～42℃水溶液中快速復溫，以減少組織過冰點時細胞再結晶的形成。

　　我們在快速復溫過程中，采用37℃恒溫水浴箱復溫，水溫始終保持于37℃左右，并快速解除包裹塑料膜，再在無菌溶液中梯度融解，冷凍保護劑得到及時稀釋，從而維持了組織細胞內外滲透壓的平衡，組織破壞較輕，并在順梯度濃度稀釋時加用適量營養液，從而最大可能地保留了瓣膜組織活細胞。瓣膜組織觀察的指標有組織結構、組織活性、細胞增殖能力、代謝功能、細胞特異性抗原鑒定等，其中組織活性和細胞增殖能力是反映瓣膜是否具有活性的兩個重要指標。活性是指細胞或組織維持自身和與外界能進行正常交換的能力，組織活性主要觀測細胞活力，包括內皮細胞和纖維細胞的活力;細胞增殖能力則主要觀察組織細胞培養后的生長情況。細胞活力測定可定量反映瓣膜組織細胞存活程度。從實驗結果可以看出，新鮮瓣膜的細胞活力最高，且細胞增殖能力較高，說明新鮮瓣膜最大限度地保留了組織活細胞，組織結構較完整，細胞增殖活躍。液氮保存的瓣膜組織細胞活力均較新鮮瓣膜顯

　　著減低，說明液氮保存1mo的瓣膜組織細胞即出現損傷情況，且其程度與瓣膜冷凍保存時間呈正相關關系，冷凍保存時間愈長，瓣膜組織細胞損傷愈重，組織細胞存活率愈低。理論上認為，液氮保存時組織代謝接近停止，瓣膜活細胞可長期保存，但瓣膜組織代謝雖處于低水平，卻沒有完全停止，細胞仍處于緩慢的無氧代謝過程，細胞內外可能仍有離子交換及滲透壓的改變，隨保存時間延長，細胞內外代謝產物不斷積累，以及冷凍降溫過程中各種物質濃度積累到有害程度，可導致細胞完整性的破壞，從而使細胞受到損傷。液氮保存1～15mo瓣膜組織活細胞在60%以上，組織培養后的細胞生長情況較好，證明液氮保存1～15mo的瓣膜組織保留大部分的組織活細胞，且細胞增殖能力仍在較高水平，瓣膜組織活性較高。而液氮保存18～24mo瓣膜組織活細胞在50%或以下，且細胞增殖能力較差，雖然保留了部分組織活細胞，但從整體上看，瓣膜組織活性較低，因此臨床應用價值較小。

　　綜上所述，液氮保存可影響瓣膜的組織代謝和活性，其程度隨保存時間延長而逐漸加重。結合形態學及相關資料可以認為，液氮保存1～15mo瓣膜組織活性仍較高，瓣膜組織代謝相對處于較高水平，臨床應用價值較大;而液氮保存18～24mo瓣膜組織活性明顯減低，瓣膜組織代謝相對處于較低水平，瓣膜活性較差，其臨床耐久性可能減小。因此可認為，人同種主動脈瓣膜保存期限以15mo以內為宜。