凍存在-196℃液氮罐中的細(xì)胞復(fù)蘇方法

細(xì)胞復(fù)蘇的原則－快速融化：必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。

一、 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

1、將水浴鍋預(yù)熱至37℃

2、用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面。

3、在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好消過(guò)毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。

二、取出凍存管：

1、根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號(hào)。

2、從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。

三、迅速解凍：

1、迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化。

2、約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。

四、平衡離心：

用架盤天平平衡后，放入離心機(jī)中3000r/min 離心3min

五、制備細(xì)胞懸液：

1、吸棄上清液。

2、向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。

六、細(xì)胞計(jì)數(shù)：

細(xì)胞濃度以5×105/ml為宜。

七、培養(yǎng)細(xì)胞：

將復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時(shí)（或者24-48小時(shí)）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時(shí)間由細(xì)胞情況而定。

初學(xué)者易犯錯(cuò)誤：

1、水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃。

2、水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時(shí)間延長(zhǎng)。

3、離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。

4、一次復(fù)蘇細(xì)胞過(guò)多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。液氮罐